Projektergebnisse

vasQlab@KIT: Materialauswahl & Charakterisierung

AP2: Materialauswahl und Charakterisierung, vasQlab@KIT

Das StartUp vasQlab entwickelte und charakterisierte im Rahmen des Projekts neuartige Hydrogele und sensorische Biotinten für das 3D-Bioprinting. Weiterhin wurden „selbstheilende“ Gele entwickelt. Die Festigkeit der Gele ist durch die Verwendung verschiedener Crosslinker flexibel einstellbar. Hierzu wurden auch verschiedene Patente wurden angemeldet.
Layer-by-Layer-Druck-Experimente mit dem Biofluidix-3D-Bioprinter zeigten sehr gute Ergebnisse. Unter anderem gelang der Druck von Neuronen. Weitere Organ-on-Chip-Modelle, z.B. das Hautmodell wurden untersucht.

Synthese neuartiger photopolymerisierbarer Biotinten auf Gelatinebasis

BioFluidix GmbH: 3D-Bio-Printer & Drucktechnik

AP3, 3D-BioPrinter & Drucktechnik, BioFluidix GmbH

Die Aufgabe der BioFluidix war die Entwicklung einer flexibel einsetzbaren Plattform zur strukturierten Erzeugung lebender Gewebe. Die Basis für das Gerätekonzept des 3D Bioprinters stellte die bestehende BioSpot® Automatisierungsplattform der BioFluidix. Das Know How im Bereich der Automatisierungstechnik und der Handhabung kleinster Flüssigkeitsmengen wurde eingebracht, um den gemeinsam mit den Projektpartnern erarbeiteten Anforderungen gerecht zu werden. Im Speziellen sollte das Gerätekonzept die Temperierung der unterschiedlichen Dosierkanäle und der Aufnahme der Substratplatten erlauben, um die temperatur-sensitiven Biotinten kontrolliert verarbeiten zu können. Für den Druck von biokompatiblen Kunststoffen, Hydrogelen und lebenden Zellen erweiterte die BioFluidix bestehende Drucktechnologien, um die geforderten Spezifikationen zu erfüllen. Als Ziel sollte der Materialverbrauch sowie die Betriebskosten reduziert werden und gleichzeitig eine anwenderfreundliche Bedienbarkeit implementiert werden. Mit der Konstruktion eines 3-fach Druckkopfes wurden verschiedene Drucktechniken über einen weiten Volumenbereich (pl, nl, µl) kombiniert und auf einem Gerät integriert (PipeJet®, SiJet, Extrusion). BioFluidix entwickelte im Projektrahmen insgesamt zwei High-Tech 3D Bioprinter, die dem Projektteam für einen flexiblen Einsatz zum Druck verschiedenster Biomaterialien zur Verfügung stand.

Infoteam Software AG: Softwareentwicklung

AP4, Softwareentwicklung, Infoteam Software AG

Die infoteam Software AG realisierte im Rahmen des 3D-Bio-Net-Forschungsprojekts die geräteunabhängige, normkonforme und anpassbare Softwareplattform. Um ein funktionelles und lebensfähiges 3D-Objekt drucken zu können, benötigt der Anwender ein digitales 3D-Modell, dem er unterschiedliche Füllmuster und Materialien zuordnen muss. Die Softwareplattform unterstützt den Anwender trotz der erhöhten Komplexität von biologisch druckbaren Objekten mit einer intuitiven Benutzeroberfläche. So kann er das Verwalten von Modellen, Materialien und Füllmustern sowie das Speichern aller Parameter vornehmen, wobei die Software die im Medizinbereich notwendige Datensicherheit und Datenintegrität gewährleistet. Zugleich liefert die Plattform auch ein integriertes Slicing-Verfahren, das 3D-Objektmodelle in spezifische Anweisungen für den Drucker übersetzt. Herkömmliche Algorithmen arbeiten hier gänzlich anders, als es für Bioprinting notwendig ist. Innerhalb der Softwareplattform kommt deshalb ein optimierter Slicer-Algorithmus zum Einsatz, der mehrere komplexe und multimaterielle Füllmuster berücksichtigt, um die Objektstabilität sowie die Zufuhr von Sauerstoff und Nahrung für die Zellen zu sichern. Der Algorithmus ist patentgeschützt und steht bereits im Fokus zahlreicher europäischer Hersteller für 3D-Bioprinter.

CellGenix GmbH: Regulatorische Anforderungen

AP5, Regulatorische Anforderungen, CellGenix GmbH

CellGenix GmbH übernahm in dem Projekt die fortlaufende Recherche der regulatorischen Anforderungen und deren Anwendung an eine 3D-Bio-Printing-Plattform, insbesondere für „Organ-on-Chip“ Applikationen und klinische Anwendungen.

3D-gedruckte Erzeugnisse für klinische Anwendungen sind als Arzneimittel einzustufen, die jedoch als patientenspezifische Einzelfertigungen nicht nach klassischem Muster geprüft werden können. Zu dieser neuartigen Situation wurde die Expertise des Paul-Ehrlich-Instituts (PEI) eingeholt (Deutschlands oberstes Institut für die Bewertung von Impfstoffen und biomedizinischen Arzneimitteln). Auf Basis dieser Einschätzung wurde gemeinsam mit allen Projektpartnern eine umfassende Risikoanalyse als zentrales Qualitätssicherungs-Element angefertigt, woraus sich spezifische Rahmenanforderungen für Konstruktion und Prozess ergaben, wie z.B. eine kontrollierte Atmosphäre, spezifische Anforderungen an Zellkultur-Rohmaterialien (Hydrogele, Zellkulturmedien, Wachstumsfaktoren), Anbindungen der Druckköpfe, steriler Probenzug für Qualitätsprüfungen.

Insgesamt handelt es sich um ein völlig neuartiges Konzept, das in dieser Form noch nie verwirklicht wurde. Umso mehr sind diese Vorarbeiten essenziell, um eine spätere Zulassung für medizinische Zwecke und anschließenden wirtschaftliche Verwertbarkeit sicher zu stellen.

Kunststoffinstitut Südwest: Schnittstellen Open Source und konventionelles 3D-Printing

AP6, Schnittstellen Open Source und konventionelles 3D-Printing, Kunststoffinstitut Südwest

Das Kunststoff-Institut Südwest übernahm die Anforderungsdefinition der Datenaufbereitung für den 3D-Bioprinter. Einbezogen wurden Eingangsformate von 3D-Daten, die Multi-Materialverarbeitung und Parametrierbarkeit sowie die Bedienoberfläche und Verwertbarkeit der projekteigenen Software. Dazu sind Workflows zur Datenerzeugung erstellt und diverse G-Code-Befehle recherchiert worden.

Workflow zur Datenaufbereitung

Des Weiteren sind anhand zugänglicher Open-Source, und mittels diverser 3D-Daten, verschiedene Systeme getestet und evaluiert wurden. Mit den gewonnen Erkenntnissen konnten Steuerung, Prozessierung, Slicing und Visualisierung betrachtet und zum Teil in die Software etabliert werden.

Open-Source-Test: Parametrierung & Slicing

Zuletzt war die Eigenschaftsermittlung von Kunststofffilamenten und Druck-erzeugnissen aus bioresorbierendem Polymeren ein weiterer Bestandteil des Teilprojekts. Der Untersuchungsumfang umfasste die Ermittlung mechanischer (Zug-)Eigenschaften, Viskositätszahlen, DSC-Untersuchungen, Bewertung druck-technischer Geometrien und deren Oberflächenbeschaffenheit, Material-inkubation und Betrachtung der Zytokompatibilität und Zellvitalität sowie Löslichkeitstest polymerer Strukturen.

Abwicklung eines Druckauftrags

Betrachtung Zellvitalität und -wachstum; weiße Punkte: abgestorbene Zellen

Universität Freiburg, Institut für Mikrosystemtechnik IMTEK: Prozessentwicklung 3D-Bio-Printing

AP7, Prozessentwicklung 3D-Bio-Printing, Universität Freiburg, Institut für Mikrosystemtechnik IMTEK

Das IMTEK übernahm in dem Projekt die Entwicklung generischer 3D-Bioprintingprozesse auf Basis des im Projekt entwickelten 3D-Bioprinters unter Nutzung seiner innovativen Merkmale wie der sterilen Verarbeitung von Biomaterialien mit Hilfe von Einwegkomponenten und der kombinierten Nutzung von drei unterschiedlichen Druckverfahren. Für ein in vivo Knochenersatzmodell des UKF konnten mittels eines neu entwickelten Hybrid 3D-Bioprintingprozesses Konstrukte aus mehreren Zelltypen und Biotinten gedruckt werden, die nach subkutaner Implantation in Mäusen in der Lage sind eine kalzifizierte Knochenmatrix und perfundierte Blutgefäße auszubilden (Rukavina et al., 2020). Darüber hinaus wurde ein prädiktives System auf Basis der rheologischen Eigenschaften von Hydrogelen und der Druckparameter entwickelt, mit dem nicht nur die Druckbarkeit der Materialien, sondern auch die Formtreue des gedruckten Konstrukts sowie die zu erwartenden Viabilität der Zellen im gedruckten Konstrukt vorhergesagt werden können (Koch et al., 2020). Des Weiteren konnten 3D-Bioprintingprozesse mit fotohärtbaren Biotinten in Zusammenarbeit mit dem KIT für ein in vivo Knorpelersatzmodell des UKF und mit bioresorbierbaren Kunststoffen zusammen mit dem KISW entwickelt werden.

Abbildung 1. Komponenten der 3D-Bioprinting Prozessentwicklung

Referenzen:
Koch, F., Tröndle, K., Finkenzeller, G., Zengerle, R., Zimmermann, S., and Koltay, P. (2020). Generic method of printing window adjustment for extrusion-based 3D-Bioprinting to maintain high viability of mesenchymal stem cells in an alginate-gelatin hydrogel. Bioprinting. Volume 20, December 2020, e00094

Rukavina, P., Koch, F., Wehrle, M., Tröndle, K., Stark, G.B., Koltay, P., Zimmermann, S., Zengerle, R., Lampert, F., Strassburg, S., Finkenzeller, G., and Simunovic, F. (2020). In vivo evaluation of bioprinted pre-vascularized bone tissue. Biotechnology and Bioengineering. 2020 Aug 4. doi: 10.1002/bit.27527.

Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen:
Erprobung & Charakterisierung „Organ-on-Chip“

AP8, In-vitro Modell des proximalen Tubulus, Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universität Tübingen

Eine Frage, die Pharmazeuten und Mediziner beschäftigt ist, wie Nebenwirkungen eines Medikaments frühzeitig erkannt werden können. Konkret geht es darum, schädliche Effekte noch vor der klinischen Phase zu identifizieren, bei der ein Wirkstoff an menschlichen Probanden getestet wird. Mit Zellkulturtests, wie sie derzeit zu meist verwendet werden, gelingt dies nicht hinreichend zuverlässig. Grund dafür ist, dass sie die Situation im Organismus nicht gut nachbilden. Die möglichst naturgetreue Nachbildung der kleinsten funktionellen Einheit von Organen in mikrofludischen Organ-on-chip-Modellen soll die Vorhersagekraft wesentlich verbessern. Im AP8 arbeiteten die Wissenschaftler des NMI an einem Modell des proximalen Tubulus der Niere. Dieser Teil ist besonders durch Medikamentennebenwirkungen betroffen. Mit Hilfe des 3D-Bioprinters wurden hohle Strukturen in Mikrofluidikchips (entwickelt vom Partner ibidi, AP10) erzeugt und mit Zellen besiedelt, die für dieses Organ typisch sind. Ähnlich wie im Organ selbst übernehmen die Zellen im Modell Aufgaben wie den Rücktransport von Wasser, Salzen und anderen wichtigen Stoffen aus dem Primärharn zurück ins Blutgefäßsystem. Wir konnten einen Druckprozess etablieren und zeigen, dass die Zellen wie im natürlichen Vorbild eine dichte Barriereschicht ausbilden. Dieses Testmodell kann nun zur Untersuchung von Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden, um potenziell schädliche Nebenwirkungen zu erkennen. Darüber hinaus kann das Modell zu einem besseren Verständnis dieses Teils der Niere verhelfen.

3D-Bioprinting in Mikrofluidikchip (links), Tubulusstruktur im Mikrofluidikchip mit Zellen des proximalen Tubulus besiedelt.

3D-Aufnahme eines vollständigen Tubulusmodells. Die blaue Färbung kennzeichnet die Zellkerne der die Hohlstruktur besiedelnden Zellen.

Universitätsklinikum Freiburg, Klinik für Plastische und Handchirurgie:
Charakterisierung & in vivo Experimente „Knochen & Knorpel“

AP9, Charakterisierung & in vivo Experimente „Knochen & Knorpel“, Universitätsklinikum Freiburg, Klinik für Plastische und Handchirurgie

Die Klinik für Plastische und Handchirurgie am Universitätsklinikum Freiburg (UKL) übernahm in diesem Projekt die Bereitstellung von biologischen Komponenten und die Evaluation der mittels 3D-Bioprinting hergestellten artifiziellen Knorpel- bzw. Knochenkonstrukte in vitro und in vivo. In diesem Zusammenhang wurden unterschiedliche Zellquellen für mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Endothelzellen (ECs) getestet in Bezug auf die Unterstützung der Knochenbildung und der Vaskularisation in gedruckten Ersatzgeweben. Des Weiteren wurden auch eine große Anzahl unterschiedlicher Biotinten evaluiert in Bezug auf die Unterstützung der Vitalität, Proliferation und Differenzierung von MSCs und ECs. Es konnten hierbei sowohl ideale Zellquellen, als auch ideale Hydrogele identifiziert werden für den Extrusionsdruck von MSCs und den DoD-Druck von ECs. Die gedruckten Konstrukte wurden auch in vivo in einem subkutanen Mausmodell der Knochen- bzw. Knorpelbildung getestet, mit sehr guten Ergebnissen. Die in diesem Projekt gewonnenen Erkenntnisse in Bezug auf das Bioprinting von Knochen- und Knorpelgewebe wurden in insgesamt 8 Fachartikeln veröffentlicht. Im Rahmen dieses Projektes wurden 5 medizinische Doktoranden ausgebildet.

gedruckter Würfel mit Blutgefäßen zur Herstellung von vaskularisiertem Knochengewebe. MSCs wurden mittels Extrusion gedruckt und ECs mittels DoD.

humanes Blutgefäß, welches aus dem DoD-Druck von ECs in einem Knochenkonstrukt welches in eine SCID Maus implantiert wurde, entstanden ist.

ibidi GmbH: Inkubations- & Perfusionsplattform

AP10, Inkubations- & Perfusionsplattform, ibidi GmbH

Die Aufgabe von ibidi innerhalb des Verbundprojekts war die Etablierung einer Inkubations- und Perfusionsplattform für die Langzeitkultivierung von gedruckten Organ-On-Chip Strukturen. Der hierfür erforschte Perfusions-Chip welcher als sterilisierbares Einwegteil ausgelegt wurde, stellt die Perfusion mit Nährstoffen, für die gedruckten Gewebe sicher und ermöglicht auch Wirkstoffexperimente mit diesen. Somit ist der Chip mit der zugehörigen Peripherie das entscheidenden Werkzeug zum Erhalt bzw. Weiterverarbeitung gedruckter Gewebe. Für die Kultivierung der 3D-Zellstrukturen in den Chipkammern wurden entsprechende Protokolle etabliert. Wichtig war dabei z.B. die blasenfreie Befüllung der fluidischen Kanäle und Zellkammern. Die Protokolle beinhalten u.a. die geeigneten Zellmedien und die Perfusionsraten für die Durchführung von Langzeitkultivierungen. Der Chips und die Peripherie für die Perfusion wurde mit gedruckten Zellstrukturen (Zusammenarbeit mit AP8, 9) über lange Zeiträume (≥ 14 Tage) getestet. Dabei wurden die Morphologie, Vitalität und Stabilität in kontinuierlichen Abständen optisch untersucht. Darüber hinaus wurden auch Tests mit Referenzsubstanzen durchgeführt um den Einfluss auf die Zellstrukturen zu untersuchen.

Links:Schematische Zeichnung des Perfusionschips mit gedruckten Strukturen, rechts: NucBlue Live Cell Stain mit HUVEC Zellen unter Perfusion im Chip.

microTEC Südwest e.V.: Projektmanagement und Öffentlichkeitsarbeit

AP11, Projektmanagement und Öffentlichkeitsarbeit, microTEC Südwest e.V.

microTEC Südwest übernahm in dem Projekt das Projektmanagement, die Gesamtkoordination sowie die Öffentlichkeitsarbeit. Neben der Bekanntmachung der Ergebnisse über Konferenzen, Messen und Presse war die Gewinnung weiterer Value-Partner für das Netzwerk und die Fortsetzung der Aktivitäten nach Ende der Projektlaufzeit ein ganz wesentlicher Aspekt. Das Thema des 3D-Bioprinting löste ein großes öffentliches Interesse aus, was sich auch in der Anzahl der Presseartikel, Radio- und TV-Beiträge widerspiegelt und zur Bekanntmachung des Projektes beitrug. Die eigene 3D-Bio-Net-Session im Rahmen der microTEC Südwest Clusterkonferenz 2019 mit Herrn Prof. Gelinsky (TU Dresden) als Keynote-Speaker war eine der meistbesuchten Sessions der Konferenz. Auch die zwei Netzwerk-Veranstaltungen und Workshops mit insgesamt über 80 Teilnehmenden stießen auf großes Interesse sowohl von Seiten der Industrie als auch Academia. Als Abschluss des Projektes wurde ein Imagefilm erstellt, der in Kürze die beteiligten Partner und den Drucker als Herzstück des Projektes darstellt. Alle Projekt-Aktivitäten und Veröffentlichungen finden sich auch unter „Aktuelles“.